基因工程\n课前自主预习案高效课堂课堂总结历届真题\n课前自主预习案\n素能目标★考向导航\n基础梳理——系统化知识点一 基因工程的基本工具磷酸二酯键平末端磷酸二酯键黏性末端平末端质粒动植物病毒限制酶切割位点标记基因\n知识点二 基因工程的基本操作程序基因文库PCR启动子标记基因\n农杆菌转化显微注射DNA分子杂交抗原—抗体杂交\n知识点三 蛋白质工程基因合成新的蛋白质蛋白质结构脱氧核苷酸序列\n基能过关——问题化一、判一判1．有关工具酶的判断(1)限制酶只能用于切割目的基因。()(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。()(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。()(4)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(5)限制酶也可以识别和切割RNA。()(6)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。()××××××\n2．有关载体的判断(1)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。()(2)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。()(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()(4)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。()(5)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。()×√√√×\n3．有关基因工程原理与操作的判断(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。()(2)用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。()(3)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()(4)抗虫基因即使成功插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。()(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。()(6)应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。()×√×√√×\n4．有关基因工程应用及蛋白质工程的判断(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，可能获得能产生人干扰素的菌株。()(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。()(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。()(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。()(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，可定向改变分子的结构。()√××√×\n二、议一议【教材易漏拾遗】1．[选修3P6“寻根问底”]DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？提示：不是一回事。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的单链上。\n2．下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图，据图分析：(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。(2)以上实例说明限制酶有何特性？提示：EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在C和G之间。提示：说明限制酶具有专一性。\n3．据图分析抗虫棉的培育过程(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？提示：目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。\n(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？提示：采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又可插入到T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。\n高效课堂\n考点一 基因工程的概念及操作工具(国考5年5考)(全国卷：2021全国乙卷；2020全国卷Ⅲ；2019全国卷Ⅰ；2018全国卷Ⅰ、Ⅱ)任务驱动·探究突破任务1对基因工程概念的理解基因工程的别名基因拼接技术或________技术操作环境________操作对象基因操作水平________水平原理________DNA重组生物体外DNA分子基因重组\n基本过程剪切→______→______→表达结果人类需要的________或生物类型供体提供________受体表达目的基因本质目的基因在________体内的表达优点可________生物的遗传性状拼接导入基因产物目的基因受体定向改造\n任务2对DNA重组技术中基本工具的理解(1)限制性核酸内切酶(简称：________)限制酶原核生物磷酸二酯键特定的核苷酸序列黏性末端平末端\n特别提醒正确认识限制酶①限制酶是一类酶，而不是一种酶。②将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。③不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。④限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。⑤限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。\n(2)DNA连接酶常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源________T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端和平末端结果都缝合__________，如图大肠杆菌磷酸二酯键\n(3)载体①种类：______、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。②质粒的特点质粒限制酶切割位点标记基因\n任务3下图为限制酶和DNA连接酶的关系，据图回答(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？________。(2)DNA连接酶起作用时是否需要模板？__________。相同不需要\n特别提醒选择限制酶的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点来确定所用限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。\n(2)根据质粒的特点来确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。如果所选酶的切点不只一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。\n任务4与DNA有关的酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶___________DNA将DNA切成两个或多个片段DNA连接酶___________DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键__________将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端DNA(水解)酶__________DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键________将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶__________核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端磷酸二酯键磷酸二酯键脱氧核苷酸磷酸二酯键DNA磷酸二酯键\n任务5探究载体所具条件的意义条 件意 义稳定并能自我复制_________________________有一个至多个限制酶的切割位点_________________________具有特殊的标记基因_________________________目的基因稳定存在且数量可扩大可携带多个或多种外源基因便于重组DNA的鉴定和选择\n特别提醒基因载体与膜载体的区别基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，它能在宿主细胞内稳定存在，并可对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。\n考向分类·对点落实考向一基因工程操作工具的基础考查1.[北京卷，5]用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图2中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案：D\n解析：限制酶可识别特定的核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构建重组DNA，B正确；SalⅠ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶只能切割双链DNA，D错误。\n2．[经典模拟]如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②答案：C\n解析：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此该酶可作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此该酶可作用于④；DNA连接酶能在具有相同黏性末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此该酶可作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。故选C。\n3．[2022·江苏省东台中学高三检测]“工欲善其事，必先利其器”。限制酶、DNA连接酶的发现为DNA切割、连接功能基因的获得以及表达载体的构建创造了条件，下列关于限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是()A．两者都是从原核生物中分离纯化出来的B．两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变C．限制酶都能在特定位点切割产生黏性末端D．T4DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端答案：B\n解析：T4DNA连接酶是从T4噬菌体分离出来的，A错误；限制酶可以切割磷酸二酯键，DNA连接酶可以催化磷酸二酯键的形成，故两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变，B正确；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端，C错误；T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，D错误。\n4．[经典模拟]近年诞生的CRISPR/Cas9基因编辑技术可进行基因定点编辑。CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(核酸内切酶)和向导RNA，其原理是由向导RNA引导Cas9到一个特定的基因位点进行切割(上述过程见下图)。下列相关叙述，正确的是()A．CRISPR/Cas9的组成物质是在核糖体上合成的B.向导RNA的合成需要逆转录酶的参与C．基因的定点编辑过程只涉及碱基A—U，G—C的互补配对D．切割后形成的每个DNA片段均含有两个游离的磷酸基团答案：D\n解析：CRISPR/Cas9系统主要包括Cas9(核酸内切酶)和向导RNA，前者是在核糖体上合成，后者是通过转录形成的，其场所不在核糖体，A错误；向导RNA可通过转录形成，逆转录酶以RNA为模板合成DNA，B错误；向导RNA和目标DNA互补配对过程中，涉及的配对方式有A—U、G—C、T—A、C—G，C错误；由于DNA分子是双链结构，因此切割后形成的每个DNA分子的片段中均含有2个游离的磷酸基团，D正确。\n考向二基因工程操作工具的综合考查5.[2022·湖北高三模拟]大米铁含量极低，科研人员通过基因工程、植物组织培养等现代生物技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下图为培育转基因水稻过程示意图，其中①～⑥为过程，EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ为限制酶。\n(1)该转基因水稻培育过程中选取目的基因用到的限制酶是________________。这么操作的优点是____________________________________________。(回答3点)(2)PCR是获取大量目的基因的一种方法，反应体系的成分中有两种引物，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因_____________________________________________________；下图展示了用PCR技术从DNA分子中获取铁合蛋白基因的过程，A、B、C、D是四种引物，选择图中的________引物通过PCR三次循环就可将铁合蛋白基因分离出来。(3)图中④⑤⑥过程，属于______________技术，制备的培养基是由无机营养成分、有机营养成分、____________四部分组成。BamHⅠ和HindⅢ防止自身环化，避免反向连接，防止目的基因被破坏防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率B和C植物组织培养激素、琼脂\n解析：(1)图中①过程为基因表达载体的构建。若选用EcoRⅠ，会破坏目的基因；由于目的基因两侧的酶切位点被HindⅢ、BamHⅠ识别，且质粒中也存在同样的酶切位点，则所选用的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ。使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以避免目的基因和质粒的自身环化，也可以避免反向连接，不用EcoRⅠ，可以防止目的基因被破坏。(2)两种引物之间若能碱基互补配对，会导致引物结合形成双链，会降低引物与DNA模板链结合的效率。DNA聚合酶不能连接单个的脱氧核苷酸，只能把单个的脱氧核苷酸添加到已有DNA片段的末端。子链延伸方向为5′→3′端，故要扩增目的基因，只能选择引物B和C。(3)据图分析，④⑤⑥过程属于植物组织培养，植物组织培养一般用固体培养基，需要加入琼脂，同时需要控制生长素和细胞分裂素的比例，以调控细胞的分裂和分化。因此制备的培养基是由无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成。\n6．[全国卷Ⅲ，40]图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。图(b)\n根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_______________________________________。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是______________________________________________________________________________________。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_______________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_____________。Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶\n解析：(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样，目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达出目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端，又能连接平末端的是T4DNA连接酶。\n7．[全国卷Ⅱ，40]植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的________基因；而cDNA文库中含有生物的_____________________基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中____________________出所需的耐旱基因。全部部分(其他合理答案也可)筛选(其他合理答案也可)解析：(1)基因文库有两种：基因组文库和部分基因文库，基因组文库含有生物的全部基因；cDNA是以mRNA为模板逆转录得到的，而细胞中只有部分基因表达，所以cDNA文库含有生物的部分基因。(2)建立基因文库后，要根据目的基因的特性从中筛选出目的基因。\n(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物_______的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的________________________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了__________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。乙表达产物(其他合理答案也可)耐旱性同源染色体的一条上解析：(3)目的基因与载体构建成基因表达载体后，应导入乙植物细胞(受体细胞)，并需要进行表达产物(蛋白质)和生物个体水平(耐旱性)等的检测。(4)若是整合到同源染色体的两条上，则此耐旱二倍体植株为纯合子，其自交后代不会发生性状分离，所以根据实验结果可推测：该耐旱基因整合到了一对同源染色体的一条上。\n8．[经典高考]根据基因工程的有关知识，回答下列问题。(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATTC……GG……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是____________________________________________。平末端黏性末端切割产生的黏性末端与EcoRⅠ切割产生的黏性末端相同解析：(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的黏性末端相同，故用另一种限制酶切割产生的黏性末端必须与EcoRⅠ切割产生的黏性末端相同。\n(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即_______DNA连接酶和_______DNA连接酶。(4)反转录的模板是____________，产物是____________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________________________________技术。(5)基因工程中除质粒外，__________和_____________也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是______________________________________。T4E·colimRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(聚合酶链式反应或多聚酶链式反应)动植物病毒λ噬菌体衍生物未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱\n解析：(3)根据酶的来源不同，DNA连接酶分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为反转录，若要体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外λ噬菌体衍生物和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时，常用Ca2＋处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。\n考点二 基因工程的基本操作程序及应用(国考5年7考)(全国卷：2021全国甲卷；2020全国卷Ⅲ；2019全国卷Ⅰ；2018全国卷Ⅰ；2017全国卷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)任务驱动·探究突破任务1结合抗虫棉的培育过程图填空\n(1)从图中可以看出，目的基因是____________，使用的载体是________，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是____________。(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法：_____________________________________。Bt毒蛋白基因Ti质粒农杆菌转化法抗原—抗体杂交法、用棉铃、嫩叶饲喂棉铃虫\n任务2观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序\n(1)—↓(2)—组成↓基因文库PCR启动子标记基因\n(3)将目的基因导入受体细胞—方法↓农杆菌转化法花粉管通道法显微注射\n(4)目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交分子杂交抗原—抗体杂交个体生物学水平\n易错提醒基因工程操作的四个易错点(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。\n任务3目的基因的检测和鉴定是否出现杂交带是否出现杂交带是否出现杂交带是否抗虫；是否抗病\n任务4完善基因工程的应用技术名称应用植物基因工程培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和______转基因植物，利用转基因改良植物的品质动物基因工程提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产______，用转基因动物作________的供体基因治疗把________导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗抗逆药物器官移植正常基因\n任务5探究基因治疗与基因诊断的不同点原理操作过程进展基因治疗________利用________导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗临床实验基因诊断__________制作特定________与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用基因表达正常基因碱基互补配对DNA探针\n任务6研析深化教材，析因推理归纳，提升学科素养(1)用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库的构建过程。提示：基因组文库的构建过程为：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。\n(2)为什么不同生物的基因可以拼接起来？(3)为什么一种生物的基因可以在另一种生物的细胞内表达？提示：①DNA是生物的主要遗传物质；②DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。提示：①基因是控制生物性状的独立遗传单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则中遗传信息的流动方向；③生物界共用一套遗传密码。\n考向分类·对点落实考向一对基因工程操作程序的考查1.[2022·山东省高三检测]为使玉米获得抗除草剂性状，需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。\n下列叙述不正确的是()A．筛选1需要用含有氨苄青霉素的培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织C．为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的复制原点和启动子之间D．为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株答案：C\n解析：分析图解可知，该基因工程的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌，A正确；根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织，B正确；为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的启动子、终止子之间，C错误；为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株，D正确。\n2．[经典模拟]如图表示用化学方法合成目的基因Ⅰ的过程。据图分析，下列叙述正确的是()A．过程①需要DNA连接酶B．过程②需要限制性核酸内切酶C．目的基因Ⅰ的碱基序列是已知的D．若某质粒能与目的基因Ⅰ重组，则该质粒和目的基因Ⅰ的碱基序列相同答案：C\n解析：过程①仅仅是单链a和单链b之间形成氢键，不需要DNA连接酶，A错误；过程②与过程①的本质相同，故不需要限制性核酸内切酶，B错误；图中显示的是人工合成基因的流程图，因此需要知道目的基因Ⅰ的碱基序列，C正确；形成重组DNA分子的过程中，质粒与目的基因Ⅰ的碱基序列是不可能相同的，D错误。\n考向二对基因工程的综合考查3.[2022·重庆市江津中学高三模拟]黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因——葡萄糖氧化酶基因(GO)导入棉花，获得抗黄萎病棉花。已知T－DNA上的基因在农杆菌中不表达，在植物细胞中可以表达，请将转基因棉花培育步骤补充完整：\n(1)构建上图所示重组Ti质粒，用________处理农杆菌，使重组Ti质粒进入农杆菌中，将农杆菌接种到含________的LB液体培养基中振荡培养。培养适宜时间后，离心，去除上清液，加入适量MS液体培养基，可通过测定菌液在600nm波长处的OD值来确定农杆菌密度是否适宜。(2)切取经________培养的棉花幼苗的下胚轴，直接转入菌液中侵染5～10min后，倒出菌液，用灭菌滤纸吸取下胚轴表面多余菌液，将下胚轴放入愈伤组织诱导培养基中培养2天。2天后，向培养基中加入适量________和青霉素，其目的是筛选出转化成功的棉花细胞和______________。(3)将所得愈伤组织接种到适宜培养基中培养，诱导形成胚状体，在适宜人工条件下继续发育成棉花幼苗。利用__________________技术检测棉花细胞是否合成______________，选出抗黄萎病棉花。通过______________可以从个体水平上鉴定该棉花对黄萎病的抗性。CaCl2卡那霉素无菌草丁膦抑制农杆菌生长抗原－抗体分子杂交葡萄糖氧化酶病原体感染实验\n解析：(1)质粒的化学本质为DNA，构建重组Ti质粒时，遵循碱基互补配对原则；为了提高转化成功率，先用CaCl2处理农杆菌，使其成为感受态细胞，增加其农杆菌细胞壁的通透性，使得重组质粒进入农杆菌中。将农杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养，因为质粒中含有抗卡那霉素基因，故以此检测是否成功导入重组质粒。培养适宜时间后，离心，去除上清液，加入适量MS液体培养基进行培养，并通过测定菌液在600nm波长处的OD值确定农杆菌密度。(2)切取经无菌培养的棉花幼苗的下胚轴，直接转入菌液中侵染5～10min后，倒出菌液，用灭菌滤纸吸取下胚轴表面多余菌液，将下胚轴放入愈伤组织诱导培养基中培养2天。2天后，向培养基中加入适量草丁膦和青霉素，加入草丁膦可以筛选出转化成功的棉花细胞，加入青霉素可以抑制农杆菌的生长。(3)将所得愈伤组织接种到适宜培养基中培养诱导形成胚状体，在适宜人工条件下继续发育成棉花幼苗，利用抗原与抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体分子杂交技术检测棉花细胞是否合成葡萄糖氧化酶，选出抗黄萎病棉花。通过病原体感染实验可以从个体水平上鉴定该棉花对黄萎病的抗性。\n4．[全国卷Ⅰ，40]某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。\n回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________________________________；并且____________和____________________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自__________。能自我复制、具有标记基因二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素受体细胞\n解析：(1)作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；③具有一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，故不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr，因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞(受体细胞)完成DNA的复制。\n5．[2022·山东潍坊市高三三模]番茄果实后熟问题是影响番茄生产、加工和运输的难题。ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的关键酶，科学家利用反义基因技术培育出了耐储存、利于长途运输的番茄新品种，具体做法是采用农杆菌转化法将携带有反义ACC合成酶基因的重组质粒M导入番茄栽培品种中，经过卡那霉素筛选后，获得番茄新品种。反义基因是指人工合成出一段与某种基因碱基序列相同的DNA。经过人为操作使之在转录生成mRNA时，模板链与原基因不同。(1)农杆菌转化法适用的植物种类是________________________；重组质粒M中的抗性基因是________________。(2)有同学提出若要提取番茄中控制ACC合成酶的基因，只能利用成熟的番茄组织。你认为他的说法是否有道理，作出判断的依据是_____________________________________________。大多数双子叶植物和裸子植物卡那霉素抗性基因否，控制ACC合成酶的基因几乎存在于番茄的所有细胞中\n解析：(1)农杆菌转化法适用的植物种类是大多数双子叶植物和裸子植物；采用农杆菌转化法将携带有反义ACC合成酶基因的重组质粒M导入番茄栽培品种中，经过卡那霉素筛选后，获得番茄新品种。由以上可知，重组质粒M中的抗性基因是卡那霉素抗性基因。(2)控制ACC合成酶的基因几乎存在于番茄的所有细胞中，所以这位同学提出的说法没有道理。\n(3)ACC合成酶基因在番茄细胞中表达的过程发生在细胞内的_____________中；反义ACC合成酶基因转录启动后，检测发现番茄果实中乙烯含量显著降低，推测其机理最可能是________________________________________________________________________________________________________________________________________。细胞核和核糖体反义ACC合成酶基因转录产生的mRNA可与ACC合成酶基因转录产生的mRNA碱基互补配对结合，ACC合成酶的合成受阻，导致乙烯的产生量下降解析：ACC合成酶基因在番茄细胞中表达的过程包括基因的转录和翻译，发生在细胞内的细胞核和核糖体中；反义ACC合成酶基因转录启动后反义ACC合成酶基因转录产生的mRNA可与ACC合成酶基因转录产生的mRNA碱基互补配对结合，ACC合成酶的合成受阻，导致乙烯的产生量下降。\n考向三基因工程的应用6.[全国卷Ⅰ]HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的______，以其作为模板，在_________的作用下合成_____________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是_______，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是____________________。(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分__________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。(4)人的免疫系统有__________癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。RNA逆转录酶cDNA(或DNA)抗体抗原与抗体特异性结合T(或T淋巴)监控和清除\n解析：(1)HIV是RNA病毒，其核酸是单链RNA，而在基因工程中构建目的基因表达载体时，载体一般用的是质粒，为双链DNA，故先用逆转录酶催化HIV的RNA逆转录成为DNA分子，再进行基因工程操作。(2)抗原进入机体后可以产生特异性免疫反应，产生相应的抗体，抗体与抗原特异性结合。(3)HIV主要破坏人体的T细胞。(4)免疫系统除了具有防卫功能外，还有监控和清除功能：监控并清除体内已经衰老或因其他因素而被破坏的细胞，以及癌变的细胞。\n7．[天津卷，7]人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径：(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取______________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。总RNA(或mRNA)解析：总cDNA是由细胞内mRNA经逆转录获得。DNA两条链是反向平行的，另一条引物扩增方向应向左。\n(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是__________(填写字母，单选)。A.人血细胞启动子B．水稻胚乳细胞启动子C．大肠杆菌启动子D．农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_____________________________________________。(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过生物膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是_______________________________________________________。(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与________的生物学功能一致。B吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工HSA\n解析：(2)据题意可知，启动子具有物种特异性，它应与水稻胚乳细胞启动子一致，才能使目的基因转录，故选B。(3)在农杆菌转化时，加入某物质，其目的应为“促进”或“有利于”转化，推测酚类物质可吸引农杆菌侵染水稻受体细胞。(4)水稻是真核细胞，具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体。Ⅱ途径受体为大肠杆菌，没有上述细胞器。(5)制备的rHSA应具有与HSA相同的生物学功能才具有医用价值。\n考点三 蛋白质工程、转基因技术的安全性及生物武器(国考5年未考)任务驱动·探究突破任务1完善蛋白质工程概念的相关填空蛋白质工程具体内容别称第二代基因工程目标生产_____________________的一种新的蛋白质原理由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质结构进行改造，必须从________入手手段___________________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质关键技术________结果改造了现有蛋白质或制造出__________符合人类生产和生活需要基因基因修饰或基因合成基因工程新的蛋白质\n任务2完善蛋白质工程的操作过程从预期的__________出发→设计预期的__________→推测应有的__________→找到相对应的_____________(基因)→基因表达→产生所需要的蛋白质。任务3完善转基因技术安全性的相关内容(1)安全性问题①______安全：滞后效应、______、营养成分改变等。②生物安全：对___________的影响等。③环境安全：对_____________的影响等。(2)理性看待转基因技术①需要正确的社会舆论导向：________，不能因噎废食。②制定__________，最大程度保证转基因技术和产品的安全性。蛋白质功能蛋白质结构氨基酸序列脱氧核苷酸序列食品过敏原生物多样性生态系统稳定性趋利避害政策和法规\n[名师提醒]转基因生物存在安全性问题的原因(1)目前对基因的结构、调控机制及基因间的相互作用了解有限。(2)目的基因往往是异种生物的基因。(3)外源基因插入宿主细胞基因组的部位往往是随机的。\n任务4完善生物武器的相关内容(1)生物武器的种类(连线)(2)生物武器的特点①致病力强、________；②污染面广、危害时间长；③难以防治；④具有一定的________；⑤受________影响大。传染性大潜伏期自然条件\n任务5蛋白质工程与基因工程的区别和联系项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质的______→设计预期的蛋白质______→推测应有的氨基酸______→推测相对应的脱氧核苷酸______→合成DNA→表达出蛋白质_________的获取→______________的构建→将目的基因导入________→目的基因的___________实质定向改造或生产人类所需要的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果生产自然界中没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，都必须通过___________________来实现功能结构序列序列目的基因基因表达载体受体细胞检测与鉴定基因修饰或基因合成\n任务6填写蛋白质工程流程图中各字母所代表的含义A.________，B.________，C.__________，D.________，E.________。预期功能分子设计氨基酸序列转录翻译\n考向分类·对点落实考向一对蛋白质工程的考查1.[2022·宁夏石嘴山三中高三月考]目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是()①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计③蓝色荧光蛋白基因的合成④表达出蓝色荧光蛋白A．①②③④B．②①③④C．②③①④D．④②①③答案：B\n解析：蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→相应基因的修饰改造或人工合成→相应的表达。因此，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列→③蓝色荧光蛋白基因的合成→④表达出蓝色荧光蛋白。B正确。\n2．[2022·广西调研]科学家利用PCR定点突变技术可改造Rubisco酶基因，从而提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，进而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：(1)PCR过程所依据的原理是____________，该过程需要加入的酶是_________________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是_______________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是__________________________，PCR定点突变技术属于___________的范畴。(3)可利用定点突变的DNA来构建基因表达载体，常用____________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养后培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是________________。DNA双链复制热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)引物蛋白质空间结构较为复杂，改造困难能生产出自然界不存在的蛋白质蛋白质工程农杆菌转化法植物细胞的全能性\n解析：(1)PCR技术是DNA扩增的技术，所以其原理是DNA双链的复制，但是该过程需要热稳定DNA聚合酶(或Taq酶)的催化。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。(2)由于蛋白质空间结构较为复杂，改造困难，所以该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是能生产出自然界不存在的蛋白质，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。(3)将基因表达载体导入植物细胞常用农杆菌转化法；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性。\n3．[全国卷Ⅱ]已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_________________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰______基因或合成______基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_____________________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_______________________________________________________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________和________________进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。氨基酸序列(或结构)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能\n解析：(1)对蛋白质的氨基酸序列(或结构)进行改造，可达到改变蛋白质功能的目的。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因，可以对P基因进行修饰改造，也可以用人工方法合成P1基因；中心法则的全部内容包括DNA和RNA的复制、DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质结构和推测氨基酸序列，找到相对应的核苷酸序列，经表达产生的蛋白质，还要对其进行生物功能鉴定。\n考向二对转基因技术安全性的考查4.[重庆卷]生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述，错误的是()A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质B．当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，但不反对治疗性克隆C．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力答案：D\n解析：在转基因过程中，应避免基因污染和对人类的影响，必须严格选择目的基因，A正确；我国不反对治疗性克隆，坚决反对生殖性克隆，B正确；反对设计试管婴儿的原因之一是防止选择性设计婴儿，因为这违背伦理道德，C正确；生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的的一类武器，干扰素为淋巴因子，不属于生物武器，D错误。\n5．[经典高考]下列关于转基因生物安全性的叙述中，错误的是()A.我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上答案：B解析：为了维护消费者对转基因产品的知情权和选择权，我国对转基因食品和转基因农产品实行了标识制度，A正确；转基因食品上只标明原料来自于转基因生物，并未标明其危害，B错误；为保障转基因生物的安全性，可开展风险评估、预警跟踪和风险管理等措施，C正确；转基因生物是否安全的争论主要集中在它是否能保证食用安全及环境安全上，D正确。\n6．病毒疫苗的研制是现代生物技术应用最广泛的领域，现在研发的第二、三代病毒疫苗都基于DNA重组技术而建立。请分析并回答下列问题：(1)第二代疫苗是以编码病毒抗原蛋白的RNA为模板，经____________酶的作用而获得目的基因，再利用__________________这些工具酶来构建重组质粒。形成的重组质粒与经过________________处理的大肠杆菌细胞混合可转化大肠杆菌，再扩增大肠杆菌以获得大量的抗原蛋白。(2)在构建好的重组质粒中，引导目的基因表达的序列是_______，它是__________的识别和结合位点。(3)第三代疫苗即“DNA疫苗”，是将编码某种抗原蛋白的DNA注射到动物体内，该DNA可在生物体内__________出相应的抗原蛋白。(4)目前对于基因工程产品安全性的争论越来越激烈，转基因生物的安全性主要体现在__________、__________、__________三个方面。逆转录(反转录)限制酶和DNA连接酶氯化钙溶液(Ca2＋)启动子RNA聚合酶转录、翻译食品安全生物安全环境安全\n课堂总结\n[网络建构提升]限制性核酸内切DNA连接目的基因基因表达载体受体目的基因热稳定医药\n[长句应答必备]1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。2．DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。3．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。4．获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取目的基因、利用PCR获取和扩增目的基因、人工合成目的基因。5．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。6．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法。\n历届真题\n[翻阅教材品原味]1．[2021·全国卷甲]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__________(用数字序号表示)。(2)操作③中使用的酶是________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是____________________________________。(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指_____________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。④②③①热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)延伸两种引物分别与两条单链DNA模板结合病原菌DNA一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能在短时间内大量扩增目的基因\n解析：(1)用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。(2)利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是Taq酶。PCR由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。(3)要扩增病原菌DNA，设计的引物就应该能和病原菌DNA特异性结合。(4)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。\n(高考VS教材)小题号相关教材原文教材页码(2)[人教选修3]P10\n小题号相关教材原文教材页码(3)[人教选修3]P10(4)[人教选修3]P10\n2.[2021·全国乙卷]用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。\n回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。图中_____________酶切割后的DNA片段可以用E·coliDNA连接酶连接。图中____________________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有_______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是_________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指___________________________________________。EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ磷酸二酯键复制限制酶的切割位点用含抗生素的培养基进行培养RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列\n解析：(1)由图可以直接看出，EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端；E·coliDNA连接酶可用于连接黏性末端，T4DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中复制。质粒上有限制酶的切割位点，可被限制酶切开并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的选择培养基上进行选择培养的方法可将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列。\n[人教选修3]P5(高考VS教材)[人教选修3]P6(高考VS教材)\n[人教选修3]P11\n3．[全国卷Ⅰ]基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________和____________。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是_______。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_______________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________。基因组文库部分基因文库解旋酶加热至90～95℃氢键Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活\n解析：(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库。(2)体内DNA复制时，需用解旋酶打开氢键使双链DNA解旋，而PCR扩增目的基因时，可借助高温加热至90～95℃破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。(3)PCR反应体系中进行互补链的合成时，温度需控制在70～75℃，则应使用耐高温的DNA聚合酶，即Taq酶，而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。\n[人教选修3]P9(高考VS教材)[人教选修3]P10(高考VS教材)\n4．[全国卷Ⅰ，38]回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的_______方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_____________________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_______。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。体外重组的质粒可以进入体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌蛋白酶缺陷型蛋白酶\n解析：(1)将非洲爪蟾的核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞；噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。\n[人教选修3]P3(高考VS教材)[人教选修3]P13(高考VS教材)\n5．[全国卷Ⅰ，38]真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_________________________________________________________________________________________。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用______作为载体，其原因是_____________________________。因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A噬菌体噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕解析：(1)基因A的编码区中有内含子，在真核细胞内把内含子转录形成的RNA已切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后可直接参与表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。(2)由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。\n(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__________________(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是____________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________________________________。繁殖快、容易培养蛋白A的抗体DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体解析：(3)大肠杆菌常作为受体菌，这是因为其具有繁殖周期短、易培养等特点。(4)检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。\n[人教选修3]P13(高考VS教材)[人教选修3]P2(高考VS教材)\n[历届比对研考向]6．[全国卷Ⅱ]某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。\n回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____移入牛的___________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。E1和E4甲的完整甲与载体正确连接转录翻译细胞核去核卵母细胞核DNA\n解析：(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1GFP融合基因，据此，结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切则保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。(2)构建的真核生物基因表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达，基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。\n7．[2017·全国卷Ⅱ，38]几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是____________。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_______________________________________________________________。嫩叶组织细胞易破碎防止RNA降解在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA解析：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则可以合成cDNA。\n(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_________________________________________(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是___________。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________。目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子磷酸二酯键目的基因的转录或翻译异常解析：(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需的启动子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。\n8．[全国卷Ⅲ，38节选]编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图所示。回答下列问题：(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是______________________________________________。(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为______，加入了______作为合成DNA的原料。编码乙的DNA序列起始端转录出的mRNA无起始密码子模板dNTP\n解析：(1)根据题干信息中的碱基序列(TTCG……)，结合转录过程中的碱基配对原则，可知其转录出的mRNA上没有起始密码子AUG。(2)PCR技术需要的条件包括引物、耐高温的DNA聚合酶、模板、四种脱氧核糖核苷酸。\n9．[2021·广东卷]非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。\n回答下列问题：(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有__________________________。(答出两种即可)(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有________________________。(答出两种即可)(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备______细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有_________________。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是_____________________。在分子水平上，可以通过改变_________________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。基因文库中获取、人工合成法盐析法、酶解法或高温变性感受态抗原—抗体杂交技术有的酶失活而使反应中断基因的碱基序列\n解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
