微生物的培养和应用(建议用时：40分钟)1．(2020·河北省高三期末)配制培养基时可根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求，加入某些物质或除去某些营养物质以抑制其他微生物的生长，也可以根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性，在培养基中加入某种化学物质，从而筛选出待定的微生物，这种培养基叫作选择培养基。根据有关内容回答以下问题：(1)制备牛肉膏蛋白胨培养基的一般步骤是计算、称量、溶化、________、________。(2)某同学在做微生物实验时，不小心把大肠杆菌和酵母菌混合在一起。请你完成分离得到纯度较高的大肠杆菌和酵母菌的实验步骤并回答有关问题：主要步骤：①制备两种培养基：一种________的培养基，另一种加青霉素的培养基。分别分成两份，依次标上A、A′、B、B′备用。培养基应采用________法灭菌。②分别向A、B培养基中接种______________________。③接种后，放在恒温箱中培养3～4天。试说明观察到的培养结果：________________________________________________。④分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌种，接种到A′、B′培养基中。⑤接种后，把A′、B′培养基放入恒温箱中培养3～4天。第④⑤两个步骤的目的是_________________________________。[解析] (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(2)①青霉素不影响酵母菌的生长繁殖，但会抑制大肠杆菌的生长繁殖，大肠杆菌的代谢产物能与伊红美蓝发生特定的颜色反应，使菌落呈黑色，所以一种培养基加入伊红美蓝，一种培养基加入青霉素。对培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌。②分别向A、B培养基中接种混合菌。③接种后培养的结果：伊红美蓝培养基上的黑色菌落是大肠杆菌，加青霉素的培养基上生长的菌落是酵母菌。⑤分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌种，接种到A′、B′培养基中培养，目的是获得纯度较高的大肠杆菌和酵母菌。[答案] (1)灭菌 倒平板 (2)①加入伊红美蓝 高压蒸汽灭菌 ②混合菌 ③伊红美蓝培养基上的黑色菌落是大肠杆菌，加青霉素的培养基上生长的菌落是酵母菌 ⑤获得纯度较高的大肠杆菌和酵母菌2．“采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定”是从自然界筛选嗜盐菌的一般步骤。回答下列问题。(1)培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境采集，理由是______________-8-\n_____________________________________________________。(2)富集培养所用培养基为选择培养基。对嗜盐产淀粉酶微生物的富集培养时，所用培养基在组成成分上的特殊之处在于__________________。在富集培养过程中，需将锥形瓶放在摇床上振荡，目的是__________________________________________(答出1点即可)。(3)纯种分离嗜盐菌时，常用的两种接种方法有________________________________________________________________，后者的效果图如图甲所示。甲 乙(4)采用图甲和图乙所示的固体平板培养嗜盐菌时，平板要倒置培养。这样处理的目的是____________________________________________。(5)利用图甲所示接种方法统计采集菌样中微生物数量，为了使统计结果较为准确，随机预留一部分空白培养基的用途是__________________________________；统计接种的培养基中单菌落数时，每天统计的结果可能不同，应以______________________为准。[解析] (1)嗜盐菌喜好生活在高盐的环境中，因此培养嗜盐菌的菌样，应从高盐环境采集。(2)对嗜盐产淀粉酶微生物的富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基，并在高盐条件下培养。在富集培养过程中，将锥形瓶放在摇床上振荡，除了使菌株与培养液充分接触以提高营养物质的利用率外，还能增加培养液中的溶氧量，以保证微生物对氧的需求。(3)纯种分离嗜盐菌时，常用的两种接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(4)采用固体平板培养细菌时，为了防止平板冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基(或避免培养基中水分的过快挥发)，需要倒置培养。(5)利用稀释涂布平板法统计采集菌样中微生物数量，为检测培养基灭菌是否合格，应随机预留一部分空白培养基。统计接种的培养基中单菌落数时，每天统计的结果可能不同，应以每个平板上菌落数不变时的平均值为准。[答案] (1)嗜盐菌喜好生活在高盐的环境 (2)淀粉是唯一碳源，盐含量较高 使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；增加培养液中的溶氧量，以保证微生物对氧的需求(答出任意1点即可) (3)平板划线法和稀释涂布平板法 (4)防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基(或避免培养基中水分的过快挥发) (5)检测培养基灭菌是否合格 每个平板上菌落数不变时的平均值3．(2020·安徽省定远重点中学高三模拟)聚对苯二甲酸乙二酯(PET)是塑料类水瓶的重要原料，科学家发现了以PET为碳源和能量来源的细菌，该发现对PET类材料的回收利用、环境治理意义重大。请回答下列问题：(1)实验小组欲从土壤中获取PET降解菌，需将土壤样品置于以________为唯一碳源的培养基中进行选择培养，其目的是____________________________________________。-8-\n(2)该实验小组选取PET浓度为800mg·L－1的富集液进行系列稀释，分别取10－3、10－4和10－5倍数的稀释液0.1mL涂布于培养基上，每个稀释倍数涂布三个平板，各平板的菌落数分别为(286、298、297)，(35、32、31)，(36、7、2)，不适合用于计数的为________倍数的稀释液，用另外两组稀释倍数的稀释液进行计数得到的细菌数不一致的原因可能是________________________________。(3)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，目的是________________________。在倒平板的过程中，如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则这个平板不能用来培养大肠杆菌，原因是______________________________。用平板划线法纯化PET降解菌的过程中，在第二次及其后的划线操作时，须从上一次划线的末端开始划线，原因是__________________________________________________________________。(4)在保藏PET降解菌菌种时，可采取________的方法进行长期保存。[解析] (1)欲从土壤中获取PET降解菌，需将土壤样品置于以PET为唯一碳源的培养基中进行选择培养，其目的是增加PET降解菌的浓度，以确保能分离得到目的菌。(2)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，据此结合题意可知：不适合用于计数的为10－5倍数的稀释液。用另外两组稀释倍数的稀释液进行计数，得到的细菌数不一致的原因可能是稀释倍数为10－3时，更多的菌落连在一起最终形成单菌落，导致结果小于稀释倍数为10－4组的结果。(3)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，其目的是灭菌，防止微生物污染。在倒平板的过程中，如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此这个平板不能用来培养大肠杆菌。用平板划线法纯化PET降解菌的过程中，为使细菌数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落，在第二次及其后的划线操作时，须从上一次划线的末端开始划线。(4)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。[答案] (1)PET 增加PET降解菌的浓度，以确保能分离得到目的菌 (2)10－5 稀释倍数为10－3时，更多的菌落连在一起最终形成单菌落，导致结果小于稀释倍数为10－4组的结果 (3)灭菌，防止微生物污染 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生 使细菌数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落 (4)甘油管藏4．我国饮用水卫生标准规定每毫升水样中细菌总数不得大于100个，大肠杆菌不得检出。某兴趣小组为测定本地自来水中的细菌总数和是否有大肠杆菌，进行了如下实验：①分别配制营养琼脂培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、H2O)和伊红美蓝培养基(成分：蛋白胨、NaCl、琼脂、乳糖、伊红、美蓝、H2O)，灭菌。②取水样。③先测定甲项指标：用灭菌吸管吸取1mL水样，涂布到营养琼脂培养基中；置于37℃培养24h后进行菌落计数。另设一个不加水样的空白对照组。-8-\n④用滤膜法测定乙项指标，装置和操作如图。回答下列问题：(1)步骤②取水样前应先将自来水龙头用火焰灼烧3min，目的是________________。(2)步骤③测定的指标甲是________。水样涂布前无需稀释，理由是____________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)步骤④测定乙项指标，主要观察滤膜上是否会出现________色菌落。配制伊红美蓝培养基时，先用蛋白胨、NaCl、琼脂配制基础培养基，在100kPa、121℃条件下灭菌后，冷却至60℃左右，再加入经70kPa、115℃条件下灭菌的乳糖、伊红、美蓝水溶液，后者灭菌条件不同的原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)兴趣小组认为合格的自来水中细菌数量很少，担心检测不到，因而将取得的水样先加入无琼脂的营养培养液中培养一段时间后，再稀释涂布平板计数。这样操作获得的数据________(填“可信”或“不可信”)，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________。[解析] (1)实验过程要进行严格的灭菌，水龙头用火焰灼烧3min，目的是灭菌。(2)实验过程首先要测定细菌的总数，再测定大肠杆菌数，因为自来水中细菌数量很少，所以水样涂布前无需稀释。(3)指标乙是大肠杆菌，大肠杆菌在伊红美蓝培养基上会呈现紫黑色并带有金属光泽的菌落。后者灭菌条件比前者所需要的温度及压强都低，是因为后者操作过程加入了乳糖，溶液中的乳糖高温下会被破坏。(4)若将水样先加入无琼脂的营养培养液中培养一段时间后，则原有水样中的细菌就会在培养液中繁殖，稀释涂布平板计数得到的数量不能真实反映水样中原有的数量，因此这样操作获得的数据是不可信的。[答案] (1)灭菌 (2)细菌总数 自来水中细菌数量很少 (3)紫黑 溶液中的乳糖在高温下会被破坏 (4)不可信 细菌会在营养培养液中大量繁殖，实验中获得的细菌数量不能真实地反映水样中原有的数量5．(2020·湖北省高三调研)某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。(1)化合物A-8-\n为“目的菌”生长提供________。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的呼吸作用类型是________。筛选该目的菌所用培养基从物理性质上划分属于______________________。(2)若培养基需要调节pH，则应在灭菌之________(填“前”或“后”)调节。(3)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是____________________________________________。(4)若要测定培养液中选定菌种的菌体数，可用____________________法统计活菌数目。(5)将获得的3种待选微生物菌种甲、乙、丙分别接种在1L含20mg有机化合物A的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观察从实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为32小时、45小时、16小时，则应选择微生物________(填“甲”“乙”或“丙”)作为菌种进行后续培养，理由是__________________________________________。[解析] (1)培养基的基本成分是水、碳源、氮源、无机盐，因此用有机化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，有机化合物A为“目的菌”生长提供碳源、氮源。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的呼吸作用类型是有氧呼吸。筛选该目的菌所用培养基从物理性质上划分属于固体培养基。(2)制备培养基时应该先调节pH再灭菌。(3)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(4)接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可用于统计活菌数目。(5)从实验开始到微生物停止生长所用的时间，丙用时最少，说明微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强，因此应选择微生物丙作为菌种进行后续培养。[答案] (1)碳源、氮源 有氧呼吸 固体培养基(2)前 (3)检测培养基平板灭菌是否合格 (4)稀释涂布平板 (5)丙 微生物丙分解有机化合物A的能力比甲、乙强6．(2020·湖北省高三期末)酸牛奶酒是在牛奶中加入乳酸菌和酵母菌混合发酵而成的一种乳饮料。回答下列有关问题：(1)发酵所用牛奶在加入菌种前应进行________(填“消毒”或“灭菌”)。(2)已知“改良MC琼脂培养基”中含有碳酸钙，遇酸溶解而使培养基变得透明；“孟加拉红琼脂培养基”含氯霉素，可抑制绝大多数细菌的生长。对乳酸菌进行计数时应选择上述________培养基，用________法接种，挑选出________的菌落进行计数。(3)对乳酸菌、酵母菌双菌混合培养和各自单独培养过程中的活菌数进行定时检测，结果如图。由图可知，双菌培养时两种菌的最大活菌数均高于其单独培养时，从代谢产物角度分析，其原因可能是______________________________________________________。共同培养过程中两种生物的种间关系是________、________。-8-\n图甲 发酵液中乳酸菌的数量变化图乙 发酵液中酵母菌的数量变化[解析] (1)牛奶在发酵前应先进行消毒处理，除去其他微生物，再加入菌种进行发酵。(2)乳酸菌进行无氧呼吸可以产生乳酸，遇碳酸钙可以使培养基变得透明，故应该选择改良MC琼脂培养基对乳酸菌进行计数，要对乳酸菌进行计数应该选择稀释涂布平板法进行接种，乳酸菌可以使MC琼脂培养基出现透明圈，故可以挑选出具有透明圈的菌落进行计数。(3)根据图中曲线可以推测，酵母菌和乳酸菌可以相互利用对方的代谢产物，从而相互促进生长，故双菌培养时两种菌的最大活菌数均高于其单独培养时。共同培养过程中，乳酸菌和酵母菌既竞争资源空间又可以相互利用对方的代谢产物，故同时存在竞争和共生关系。[答案] (1)消毒 (2)改良MC琼脂 稀释涂布平板 具有透明圈 (3)酵母菌和乳酸菌可以相互利用对方的代谢产物，从而相互促进生长 共生 竞争7．(2020·青岛市黄岛区高三期末)污水的有效处理是人民群众健康生活的保障。请回答相关问题：(1)微生物絮凝剂具有絮凝沉降废水的作用。科研人员通过生物技术筛选稳定、高效的絮凝剂产生菌。取少量活性污泥，向其中加入________制成菌液，将菌液接种到培养基中进行富集培养，再接种到________(填物理性质)培养基，数天后，挑选出生长较好、表面光滑带黏性的____________。(2)初选菌在培养液中扩大培养后，测定其对高岭土悬液的絮凝效果，并与天然有机高分子絮凝剂作比较。实验组加入含有初选菌的培养液，对照组应该设置两组，它们是_____________________________________________________。-8-\n(3)为研究微生物絮凝剂的加入剂量对生活污水中有机物去除效果的影响(有机物污染程度用生化需氧量COD表示)，科研小组又进行了如下实验：将生活污水均分为多组，分别加入同浓度不同剂量的微生物絮凝剂，培养后取样测定COD去除率。结果如图，得出相应结论。请指出该实验设计中的不严谨之处：____________________________________________________。投加量对COD的去除效果的影响(4)反硝化细菌能将硝态氮(如NO)转化为氮气(2NO＋10e－＋12H＋→N2＋6H2O)，广泛用于污水处理。研究人员将1g活性污泥稀释成不同浓度的溶液，各取50μL稀释液均匀涂布到含有溴麝香草酚蓝(BTB)的初筛培养基上(BTB是一种酸碱指示剂，在弱酸性溶液中呈黄色，弱碱性溶液中呈蓝色，中性溶液中呈绿色，初筛培养基呈绿色)，在适宜条件下培养纯化，已获得反硝化细菌。在该步骤中，初筛培养基中的氮源应是________。在细菌培养过程中，需要放置未接种的培养基一起培养，其目的是________________________________。初培结束时，选择的目标菌落周围应呈________色。[解析] (1)制作菌液需要向活性污泥加入无菌水，富集培养后为了获得目的菌株，需要将菌液接种到固体培养基中，挑选出好的菌落。(2)由于与天然有机高分子絮凝剂作比较，所以一组对照选择加入天然有机高分子絮凝剂组，另一组选择不含初选菌的培养液组作为空白对照。(3)实验需要遵循单一变量原则，所以实验中加入不同剂量的微生物絮凝剂导致各组实验的液体总量存在差异，变量不单一。(4)反硝化细菌能将硝态氮转化为氮气，因此要筛选出反硝化细菌，步骤1中初筛培养基中的氮源应是硝态氮(或NO)，放置未接种的培养基主要目的是检验培养过程中培养基是否受到杂菌污染，初培结束时，反硝化细菌能将硝态氮转化为氮气，消耗培养基中的H＋，使溶液呈弱碱性，因此选择的目标菌落周围应呈蓝色。[答案] (1)菌水 固体 菌落 (2)加入天然有机高分子絮凝剂组，加入不含初选菌的培养液组 (3)实验中加入不同剂量的微生物絮凝剂导致各组实验的液体总量存在差异 (4)硝态氮(或NO) 检验培养过程中培养基是否受到杂菌污染 蓝8．(2020·湖南省雅礼中学高三月考)据悉，在近期举行的中国饲料发展论坛上，农业农村部兽医局局长冯忠武表示，药物饲料添加剂将在2020年全部退出，并明确了养殖端减抗和限抗的时间表。(1)药物饲料添加剂一般添加抗生素的理由是______________________。(2)滥用抗生素的后果是导致细菌的________增强，且长期使用让畜禽机体免疫力________；抗生素在畜禽产品中造成残留，对人体健康和动物产品的出口有很大的影响。-8-\n(3)某科研小组欲调查现在猪群中肠道耐抗生素微生物的比例，进行了如下实验：①培养基的配制和灭菌：分别配制含一定浓度抗生素的培养基A和________培养基B，用________法进行灭菌，倒平板备用。②菌种分离与培养：用________对猪肠腔液进行梯度稀释，每个稀释梯度取0.1mL，用________法接种到A、B培养基上各三个平板。为了排除培养基被污染，需设置________作为空白对照，然后在其他条件适宜的________(填“有氧”或“无氧”)环境中培养1～2天。③计数：选择菌落数在________的平板进行计数，计算出______________________________。(4)全面禁抗以后，对于养殖场你有什么好的建议？______________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答一点即可)。[解析] (1)抗生素具有杀菌作用，可以防治畜禽疾病，提高个人经济效益，因此药物饲料添加剂一般添加抗生素。(2)滥用抗生素的后果是导致细菌的耐药性增强，且长期使用让畜禽机体免疫力下降。(3)①分别配制含一定浓度抗生素的培养基A和不含抗生素的培养基B(相互对照)，用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，倒平板备用。②分离纯化菌种时，为了对活菌进行计数，可采用稀释涂布平板法接种于新的培养基平板上，使聚集在一起的细菌细胞分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便纯化菌种。因此，用无菌水对猪肠腔液进行梯度稀释，每个稀释梯度用稀释涂布平板法各接种A、B培养基上各三个平板；为了排除培养基被污染，需设置接种无菌水的培养基作为空白对照；因为肠道微生物适宜生活在无氧的环境中，应为厌氧型微生物，所以应该在其他条件适宜的无氧环境中培养1～2天。③计数：选择菌落数在30～300的平板进行计数，计算出A、B培养基肠腔液中微生物的比值。(4)全面禁抗以后，养殖场的牲畜发病情况会有所上升，养殖场可以：提高现场饲养管理水平，以减少疾病的发生；改善畜舍环境条件，提升动物福利，减轻应激程度。[答案] (1)抗生素具有杀菌作用，可以防治畜禽疾病，提高个人经济效益 (2)耐药性 下降 (3)不含抗生素的 高压蒸汽灭菌 无菌水 稀释涂布平板 接种无菌水的培养基 无氧 30～300 A、B培养基肠腔液中微生物的比值(肠腔液中耐抗生素微生物的比例) (4)提高现场饲养管理水平，以减少疾病的发生；改善畜舍环境条件，提升动物福利，减轻应激程度(答一点即可)-8-
