第3章 基因工程\n本章整合\n章末解题•释疑解惑直击高考•真题体验网络构建•素养展示\n网络构建•素养展示\n\n章末解题•释疑解惑\n1．提示：(1)①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶。②为了避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同种酶)切割目的基因所在片段和质粒。③切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择。(2)加入DNA连接酶。\n(3)该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。(4)白色。限制酶切割质粒时，使LacZ基因被破坏，含重组质粒的大肠杆菌不含LacZ基因，所以Xgal不会分解产生蓝色物质，菌落呈现白色。\n2．提示：(1)逆转录病毒是载体，能将外源基因Oct3/4、Sox2、c－Myc和Klf4送入小鼠成纤维细胞。(2)可以设置对照组。将转入外源基因和没有转入外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。\n(3)可以依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。(其他合理答案均可)(4)不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。\n3．提示：(1)从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。(其他合理答案均可)(2)此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。\n直击高考•真题体验\n1．(2019·北京卷)甲、乙是严重危害某二倍体观赏植物的病害。研究者先分别获得抗甲、乙的转基因植株，再将二者杂交后得到F1，结合单倍体育种技术，培育出同时抗甲、乙的植物新品种。以下对相关操作及结果的叙述，错误的是()A．将含有目的基因和标记基因的载体导入受体细胞B．通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定C．调整培养基中植物激素比例获得F1花粉再生植株D．经花粉离体培养获得的若干再生植株均为二倍体D\n解析：基因工程中需在体外先将目的基因与带有标记基因的载体结合，再将其导入受体细胞，A项正确。在个体生物学水平上，可通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定，B项正确。在花粉离体培养过程中，合理调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，可使愈伤组织再分化，获得F1花粉再生植株，C项正确。经花粉离体培养获得的若干再生植株一般为单倍体，D项错误。\n2．(2019·江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是()A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗D\n解析：基因工程菌中含目的基因，能通过繁殖遗传给子代，A项不符合题意。经组培获得的转基因植株的细胞中都含目的基因，能够遗传给子代，B项不符合题意。培育得到的转基因奶牛的细胞中都含目的基因，故能遗传给子代，C项不符合题意。由题干信息可知，进行题述基因治疗时只有淋巴细胞含目的基因，生殖细胞不含目的基因，故不能遗传给子代，D项符合题意。\n3．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__________(用数字序号表示)。(2)操作③中使用的酶是__________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是_________________________________。④②③①Taq酶(热稳定DNA聚合酶)延伸Taq酶从引物起始进行互补链的合成\n(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_____________特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指_______________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。两条单链DNA一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术\n解析：(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(2)在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶)，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。(4)据分析可知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。\n4．(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：\n请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________________________酶，它通过识别特定的___________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′—羟基与5′—磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化_____________________________。限制性内切核酸(或限制)核苷酸序列磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸\n(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是______(从引物①②③④中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′②④\n(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是_____。A.5′—AACTATGCG－－－－－－－AGCCCTT—3′B.5′—AATTCCATG－－－－－－－－CTGAATT—3′C.5′—GCAATGCGT－－－－－－－TCGGGAA—3′D.5′—TTGATACGC－－－－－－－－CGAGTAC—3′B\n解析：(1)EcoRI是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRI剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是AATTC,3′端是GAATT，故选B。\n5．(2021·广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。\n回答下列问题：(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有____________________________。(答出两种即可)(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有__________________________。(答出两种即可)基因文库中获取、人工合成法盐析法、酶解法或高温变性\n(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有____________________。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________________。在分子水平上，可以通过改变________________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。感受态抗原—抗体杂交技术有的酶失活而使反应中断基因的碱基序列\n解析：(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。\n(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。\n6．(2020·山东卷，25题)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。\n(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_______________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为______。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_________________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填：发生或不发生)改变，原因是______________________________________________。限制性内切核酸酶和DNA连接酶转化RNA聚合酶与启动子的识别和结合不发生编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子\n(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(WxmRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经__________________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是__________________________________________________________________________________。(4)各品系WxmRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为______，原因是_______________________________________________________________________________________。逆转录(或反转录)引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)品系3品系3的WxmRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强\n解析：(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫作转化。(2)根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。\n(3)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。(4)识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。\n7．(2021·河北卷)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为____________。基因组文库\n(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是___________________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是__________________________。(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是______________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。限制酶和DNA连接酶便于目的基因的筛选和鉴定农杆菌转化法避免目的基因在自然界中的扩散\n(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的______(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的______进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。耐性茎叶\n(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是___________________________________________________________________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于____________________________________________________________________________________________________________(写出两点即可)。YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用\n解析：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。\n(4)根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
